Torday Csilla¹, Fónagy Andrea¹, Kátay Lívia², Latzkovits László¹

Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Egyetem Kísérletes Sebészeti Intézet¹, Pszichiátriai Klinika², Szeged

Reaktív oxigen származékok, köztük a szuperoxid és a hidroxil szabadgyök, valamint a hidrogen peroxid felszabadulását követtük a szabadgyök rekombinációból eredő kemilumineszcencia folyamatos regisztrálása útján fiziológiás körülmények között, az erre a célra laboratóriumunkban kifejlesztett luminométerben. A készülék a petricsészében jelenlevő asztroglia tenyészeteken "in statu nascendi" felszabaduló szabadgyökök keletkezésének időbeli követésére alkalmas fiziológiás és ischaemiás körülmények között egyaránt. Primer asztroglia sejttenyészeteken vizsgáltuk a Phorbol myristate acetat (PMA), a guanylate cyclase inhibitor LY 83583, valamint az LY 83583 és a jól ismert NO^. donor a nitroprusszid natrium együttes hatására létrejövő szabadgyök produkciót, annak mechanizmusát, ill. a keletkező szabadgyök típusok relatív arányát. Intenzív, hosszantartó szuperoxid produkciót regisztráltunk LY 83583 hatására ezeken a sejteken 0.1-10 µM koncentráció tartományban ill. 0.1 nM-1µM koncentrációban PMA expozícióra. Az adott ágensek hatására generálódott és a különböző szabadgyökök interakciójából keletkező származékok karakterizálására különböző jólismert szabadgyök scavangereket alkalmaztunk. Vizsgálatainkból arra következtethetünk, hogy a gyökkeltő folyamatokban a reaktív oxigen származékok eltérő arányu keveréke keleletkezik az egymással reagáló szabadgyökök relatív arányától ill. a szövet antioxidáns kapacitásától függően. A munkát a következő pályázatok támogatták: OTKA T 026296, OTKA CW 015033, ETT 641/96, MKM FKFP 1224/1997
 
 

KIS MOLEKULASÚLYÚ HEPARIN HATÁSA A LEUKOCYTA-ENDOTHEL INTERAKCIÓKRA HAEMORRHAGIÁS SHOCK ÉS REINFÚZIÓ UTÁN

Balogh Zsolt¹, Wolfárd Antal², Simonka János Aurél¹, Boros Mihály²

SZOTE Traumatológiai Klinika¹ és Kísérletes Sebészeti Intézet²

A haemorrhagiás shock (HS) és therápiája rendszerint együtt jár a mesenteriális terület ischaemia-reperfúziójával. A kialakuló vazokonstrikció és leukocyta extravazáció bélnyálkahártya-károsodáshoz vezet, amely további szövődmények forrása lehet. A kis molekulasúlyú heparinokat (LMWH) kiterjedten használják thromboprofilaktikus célból poszttraumás állapotokban, viszont hatásuk a leukocyta-endothel interakciókra még tisztázatlan.
Kísérleteinkben megvizsgáltuk az LMWH hatását a mesenterium venuláiban kialakuló leukocyta-endothel interakciókra HS-ot és reinfúziót követően.
Módszerek: Altatott kutyák 2 csoportján 1 órás HS-ot (artériás középnyomás ~ 40 Hgmm) idéztünk elő reservoirba történő véreztetéssel, majd a reinfúzió után 3 órán át intravitális fluoreszcens mikroszkóppal monitoroztuk a mesenterium venuláiban lejátszódó leukocyta-endothel interakciókat. Az 1. csoport kezelést nem kapott, a 2. csoportot LMWH-nal kezeltük. A 3. csoport álműtött kontrollként szolgált.
Eredmények: A HS és reinfúzió szignifikánsan fokozta a leukocyta-endothel interakciókat a mesenterium venuláiban, míg az LMWH-kezelés csökkentette az endothelhez kitapadt leukocyták számát.
Következtetésünk szerint az LMWH a thrombosis prevención felül a leukocyta-endothel interakciók csökkentésével, így a leukocyta-mediálta szövetkárosodás mérséklésével is hozzájárulhat a HS therápiájának sikeréhez.
 
 

ISCHEMIA-REPERFÚZIÓS AGYI KÁROSODÁS VIZSGÁLATA KUTYÁN

Lantos János, Rőth Erzsébet, Temes Gyula

Pécsi Orvostudományi Egyetem, Kísérletes Sebészeti Intézet, Pécs

Az ischemia-reperfúziós szöveti károsodásban a reaktív gyökök fokozott képződése és a neutrofil granulociták aktiválódása jelentős szerepet játszik. Kísérleteink célja egy olyan modell kidolgozása volt, amelyben a szabadgyökök indukálta lipidperoxidációs folyamatok, az endogén scavenger státusz és a granulocita funkció nyomon követhető agyi ischemia és reperfúzió során. 10 beagle kutyán az agyat ellátó fő nyaki erek leszorításával 10 perces agyi ischemiát hoztunk létre, amit 2 órás reperfúzió követett. Az EKG, EEG, vérnyomás és carotis áramlás folyamatos kontrollja mellett vérmintákat vettünk az aortából és a v. jugularisból az ischemia előtt, majd a reperfúzió 2., 5., 15., 30., 60. és 120. percében. A reperfúzió végén az agykéregből és a velő állományból szövet mintát vettünk. Az artériás vérmintákban mértük a vérgáz paramétereket és a glükóz koncentrációt. A vénás vérmintákból és a szövetmintákból meghatároztuk a lipidperoxidációra utaló malondialdehid (MDA), az endogén scavenger redukált és oxidált glutathion (GSH, GSSG) koncentrációját, valamint a szuperoxid dizmutáz (SOD) enzim aktivitását, illetve az izolált granulociták (PMN) stimulált szuperoxid gyök termelését. A reperfúzió első 15 percében szignifikánsan megemelkedett a vér MDA koncentrációja (p<0,01), míg a GSH szint átmenetileg csökkent (p<0,05) a GSSG koncentráció (p<0,05) és a SOD enzim aktivitásának emelkedése mellett. A PMN gyöktermelő kapacitása a reperfúzió során fokozatosan csökkent. Eredményeink egyértelműen jelzik az agyi ischemia indukálta oxidatív stresszt. Az általunk alkalmazott modell alkalmasnak tűnik a reperfúziós agyi károsodást befolyásoló szerek hatásosságának megítélésére.
 
 

VAZOAKTÍV MEDIÁTOROK SZEREPE A KOLLOID-KRISZTALLOID VOLUMEN EXPANDEREK KERINGÉSI HATÁSAIBAN

Molnár Gábor¹, Kaszaki József², Nagy Sándor², Petri István³, Balogh Ádám¹, Boros Mihály²

SZOTE, Sebészeti Klinika¹, Kísérletes Sebészeti Intézet², Szeged, Területi Kórház, Szentes³

A kolloid-krisztalloid tipusú volumen expanderek alkalmazásával súlyos keringési elégtelenség esetén jelentősen javíthatók a makro- és mikrocirkuláció paraméterei. Azonban kevés adat áll rendelkezésre e folyadékterápiával kiváltható vazoaktív mediátorok felszabadulásáról és azok lehetséges szerepéről. Kísérletsorozatunk 1. csoportjában a kis volumenű (4 ml/kg), hipertóniás só-dextrán oldat (HSD, 7.2% NaCl-10% dextrán 40) hatását vizsgáltuk altatott, thorakotomizált kutyákon. A HSD 15 perces infúziója előtt és azt követően 2 órán át monitoroztuk az artériás középnyomás (MAP), perctérfogat (CO), a végszisztolés nyomás-átmérő összefüggésből számított szívkontraktilitás (MC), valamint a plazma endothelin-1 (ET), nitrit/nitrát (NOx) szintek változását és a vénás vérből izolált neutrofil granulociták (PMN) szabadgyök termelő képességét. Vizsgálataink 2. csoportjában az állatokat a volumen expanzió előtt ET-A receptor antagonista ETR-p1/fl peptiddel (50 nmol/kg) előkezeltük. A HSD infúzió 60 perces szignifikáns MAP, CO és MC növekedést eredményezett, amellyel párhuzamosan a plazma NOx és ET szintek emelkedése, valamint a PMN leukociták szabadgyök produkciójának fokozódása volt detektálható. Az ET-A receptor antagonista előkezelés gátolta a HSD okozta MAP és MC növekedést, valamint a PMN leukociták szabadgyök termelését. Következtetés: a kolloid-krisztalloid volumen expanderek a vazodilatátor NO és vazokonstriktor ET plazma szint emelkedését egyaránt kiválthatják. A kedvező korai hemodinamikai hatások létrehozásában mindkét mediátor pozitív hatású, de hosszútávon az ET által indukált szababadgyök generáció kedvezőtlen lehet. Támogatás: MKM, 93/1997;
 
 

ISCHAEMIA-REPERFÚZIÓS KÁROSODÁSOK KIVÉDÉSE ALLOPURINOLLAL VESEARTÉRIA LESZORÍTÁST KÖVETŐEN

Schmidt Emese, Mikó Irén, Szentmiklósi József¹, Oláh Anna², Hauck Mátyás, Kovács Judit³, Pető Katalin, Furka István

DOTE Kísérletes Sebészeti Intézet, ¹Gyógyszertani Intézet, ²Gyermekklinika, ³Pathológiai Intézet, Debrecen

A vese nyitott műtéteinél elkerülhetetlen az arteria renalis leszorítása. Ennek kapcsán nemcsak az irreverzibilis veseparenchyma károsodások elkerülése a cél, de a leszorított artéria endothel védelme és kontrakciós-relaxációs képességének megőrzése is. E kétféle funkció megtartása céljából végeztük kísérleteinket allopurinol (AP) alkalmazásával. 22 keverék kutyában im. narcosisban a bal veseartériát 45 percre érfogóval puhán leszorítottuk. 20 perccel a leszorítás előtt 50 mg/kg AP-t, vagy csak fiziológiás sót infundáltunk a perifériás vénába. Az ellenoldali arteriák kontrollként szolgáltak. 1 órás reperfúzió után mindkét oldali veseartériát eltávolítottuk farmakológiai vizsgálatok céljára. Az artériák noradrenalin által előidézett prekontrakciója után növekvő koncentrációban alkalmazott acetilkolin (muscarin agonista), adenozin (P₁ purinerg receptor aktivátor) és nitroglicerin (exogén NO donor) koncentrációfüggő relaxáló hatását vizsgáltuk. A xantin-oxidáz gátló AP hatása kedvezőnek bizonyult az ischaemia-reperfúziót követő endothelfüggő vascularis károsodások kivédésében.

Ez a tanulmány az ETT T-06-302/96 és T-03-307/96 támogatásával készült.
 
 
 
 
 
 

ENDOTHELIN-1 ÉS VAZOPRESSZIN HATÁSA A MESENTERÁLIS GRANULOCITA AKTIVÁCIÓRA

Fekete Zoltán, Kaszaki József, Szalay László, Nagy Sándor, Boros Mihály

SZOTE, Kísérletes Sebészeti Intézet, Szeged

Az endothelin-1 (ET) és az arginin-vazopresszin (AVP) a jelenleg ismert legerősebb vazokonstriktor hatású peptid mediátorok. Felszabadulásuk számos olyan kórállapotban (trauma, shock, szepszis) kimutatható, ahol a keringési elégtelenség és a splanchnikus terület hypoperfúziójának következményes velejárója a szabadgyököket termelő, szövetkárosító neutrofil granulociták (PMN) aktiválódása. Kísérleteinkben exogén ET (n=6) és AVP (n=5) infúzió mesenteriális hemodinamikai következményeit és PMN aktivációra gyakorolt hatásait hasonlítottuk össze altatott kutyákban. A peptideket 0.5 nmol/kg dózisban i.a. infundáltuk a terminális ileum szakaszba, hatásukat álműtött állatok (n=5) adataihoz hasonlítottuk. A kezeléseket követően 90 percig monitoroztuk a bélszegmens intramucosalis pH-ját (pHi), szegmentális érellenállását (SVR), meghatároztuk a mesenteriális vénás vérből szeparált granulociták szabadgyök termelő kapacitását és nyálkahártya biopsziákból a PMN akkumulációt jelző mieloperoxidáz enzim (MPO) aktivitását. Eredményeink szerint az AVP tranziens módon növelte az SVR-t, a pHi-t nem befolyásolta. Ezzel szemben az ET tartósan emelte az SVR-t és csökkentette a pHi-t. Az ET szignifikánsan fokozta a bélszakaszon áthaladó PMN szabadgyök termelést és az MPO aktivitást, míg az AVP csak késleltetve stimulálta a szabadgyök képzést és nem befolyásolta a mucosa MPO aktivitását. Következtetés: mindkét vazokonstriktor peptid jelentősen befolyásolhatja a vékonybél keringését, de az ET közvetlenül, vagy indirekt módon részt vehet a mesenteriális hypoperfúziót kísérő PMN aktiváció folyamatában. Támogatás: HHMI 75195, OTKA T023089 and T029495
 
 

HÍZÓSEJTEK VALAMINT GRANULOCYTÁK SZEREPE AZ ENDOTHELIN-1 KERINGÉSI HATÁSAIBAN PATKÁNYON

Szalay László, Kaszaki József, Boros Mihály

SZOTE Kísérletes Sebészeti Intézet, Szeged

Az erős vazokonstriktor endothelin-1 (ET) peptid fokozott képződését mutatták ki több hypoxiás, alacsony perctérfogattal és splanchnikus vazokonstrikcióval járó kórállapotban. Mivel mind a hízósejtek, mind a granulocyták felszínén ET-receptorok mutathatók ki, vizsgálni kívántuk e sejtek szerepét az ET hatások kialakításában. Wistar patkányokon végzett kísérleteinkben az állatok a hízósejt membránstabilizátor Na-cromoglycat (CRO, 50mg/kg), ill. az ET-A receptor antagonista ETR-p1/fl peptid (100nM/kg) előkezelést követően exogén ET (1nM/kg) infúzióban részesültek. Monitoroztuk az artériás középnyomást (MAP) és a perctérfogatot (CO), a teljes periférás érellenállást (TPR) a fenti értékekből számítottuk. A plazma hisztamin (HIS) szinteket a kezelések előtt és után vett vénás vérmintákból, a szöveti HIS szinteket, valamint a granulocyta akkumuláció markerének tekintett myeloperoxidáz (MPO) enzim aktivitását a kísérlet végén vett vékonybél biopsziából határoztuk meg. Eredményeink szerint az önmagában alkalmazott ET infúziója emelte a MAP-t, a TPR-t, a plazma HIS szintjét, valamint a szöveti MPO aktivitást; csökkentette a CO-t, és a vékonybél HIS tartalmát. Ugyanakkor mind a CRO, mind az ETR-p1/fl előkezelés szignifikánsan gátolta az ET által indukált keringési, plazma és szöveti HIS-szint változásokat. A vékonybél MPO aktivitás emelkedését az ETR-p1/fl előkezelés kivédte, a CRO nem befolyásolta. Mindezek alapján feltételezhető hogy az ET hízósejt eredetű HIS felszabadulást indukál, valamint fokozza a granulocyták szöveti akkumulációját, s ezek szerint mind a hízósejteknek, mind a granulocytáknak jelentős szerepük lehet az ET hemodinamikai hatásainak kialakításában.
 
 

BEFOLYÁSOLJA-E A PRAECONDITIONÁLÁS AZ ISCHAEMIA-REPERFUSIO KAPCSÁN KIALAKULÓ APOPTOSIST A BÉLFAL NYÁLKAHÁRTYÁJÁBAN ?

Bráth Endre, Kovács Judit¹, Mikó Irén, Hauck Mátyás, Furka István

DOTE Kísérletes Sebészeti Intézete, ¹Pathológia Intézete, Debrecen

A praeconditionálásnak védő szerepe van az ischaemia-reperfusio okozta károsodásokkal szemben. Kísérletünkben azt vizsgáltuk, hogy az ischaemia-reperfusio okozta apoptosisnak milyen az időbeni lefolyása, és a praeconditionálás hogyan befolyásolja az apoptotikus aktivitást kísérletes állatok bélfalában. Vizsgálatainkat 34 keverék kutyán -két kísérletsorozaztra osztva- végeztük. Az első sorozatban (n=24) két egyenlő, 15 cm hosszú bélszegmentet alakítottunk ki, a vizsgálatok, és a kontroll számára. Az állatokat 8 csoportra osztottuk, majd a vizsgált bélszakaszt ellátó ereket 30 percre leszorítottuk. Ezt csoportonként (n=3) 30 perc, 1, 2, 4, 6, 8, 12, vagy 24 óra időtartamú reperfusio követte. Kísérleteink második részében (n=10), hasonló műtéti protokollt követően, az állatokat két csoportra osztottuk (A=5, B=5). Mindkét csoportban 3x3 perces praeconditionálással kezdődött a kísérleti protokoll. Az A csoportban a praeconditionálást 1 órás várakozási idő követte. Ezt mindkét csoportban 30 perces ischaemia, jd 4 órás reperfusio követte. Mindkét sorozatot követően szövettani feldolgozás történt: fénymikroszkópos (HE), valamint immunhisztokémiai módszerrel apoptosis detektálása (Apoptag Kit). Apoptotikus indexet számoltunk: a pozitívan festődő sejtmagok számát elosztottuk a bélbolyhok számával. A legnagyobb apoptotikus aktivitást a 4 és 6 órás reperfusió letelte után vett mintákban találtuk (9 és 16 apoptotikus sejt/bélboholy). A második szakaszban az A csoportban 12,12 apoptotikus sejt/bélboholy eredményt kaptuk, a B csoportnál ez az érték 11,08 apoptotikus sejt/bélboholy volt. Az apoptotikus index az A csoportba 25%-kal, a B csoprtban 18%-kal növekedett.